Πλοήγηση ανά Συγγραφέας "Leledakis, Petros"

Τώρα δείχνει 1 - 1 of 1
  • Μικρογραφία εικόνας
    Τεκμήριο
    Κλωνοποίηση και έκφραση του τροποποιημένου γονιδίου της νεφρικής αποκαρβοξυλάσης της dopa στο Escherichia coli.
    (ΕΛ.ΜΕ.ΠΑ., ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ (ΣΓΕΠ), Τμήμα Γεωπονίας, 2022-06-01) Λελεδάκης, Πέτρος; Leledakis, Petros
    Οι φυτικοί δευτερογενείς μεταβολίτες είναι οργανικές ενώσεις οι οποίες δεν είναι απαραίτητες για τις φυσιολογικές λειτουργείες του φυτού έχουν όμως βασικό ρόλο στην άμυνά του καθώς και στην προσαρμογή του στο περιβάλλον. Του παρέχουν προστασία ενάντια σε αβιοτικούς και βιοτικούς παράγοντες και κατηγοριοποιούνται σε τρείς μεγάλες ομάδες, τα αλκαλοειδή, τα τερπένια και την ομάδα των φαινολικών ουσιών. Στην τελευταία ανήκουν διάφορες ουσίες που παρουσιάζουν ενδιαφέρον για την θετική επίδραση που έχουν στην υγεία του ανθρώπου με μια απ’ αυτές να είναι η υδροξυτυροσόλη. Η υδροξυτυροσόλη (3,4 Dihydroxyphenylethanol) είναι ένας δευτερογενής μεταβολίτης της ελιάς (Olea europaea) ο οποίος συναντάται κυρίως στα φύλλα αλλά και τους καρπούς σε μικρότερες ποσότητες. Είναι γνωστή για τις ευεργετικές, για την υγεία του ανθρώπου και κυρίως για την αντιοξειδωτική, αντιμικροβιακή και αντιφλεγμονώδη δράση. Η υδροξυτυροσόλη μπορεί να παραχθεί με την χρήση μεθόδων μεταβολικής μηχανικής όπου ένας μικροοργανισμός, όπως το Escherichia coli, τροποποιείται ώστε να την παράγει. Η βιοσύνθεση της υδροξυτυροσόλης επιτυγχάνεται μέσω της τροποποίησης δύο γονιδίων. Το γονίδιο της τυροσινάσης από το βακτήριο Ralstonia solanacearum και το γονίδιο της συνθάσης των αρωματικών φαινυλακεταλδεϋδων από τον μαϊντανό. Η έκφραση αυτών των δύο γονιδίων στο E.coli επιτρέπει την παραγωγή της υδροξυτυροσόλης μέσα από την δημιουργία ενός διπλού βιοσυνθετικού μονοπατιού που ξεκινάνε από την τυροσίνη, επειδή το καθένα από τα δύο προαναφερθέντα γονίδια μπορεί να δεχτεί δύο διαφορετικά υποστρώματα. Η τυροσινάση μπορεί να δεχθεί την τυροσίνη και την τυροσόλη, ενώ η συνθάση των αρωματικών φαινυλακεταλδεϋδων μπορεί να δεχθεί την τυροσίνη και την DOPA. Στην εργασία αυτή επιχειρήθηκε η βελτιστοποίηση του μονοπατιού με την αντικατάσταση της συνθάσης των αρωματικών φαινυλακεταλδεϋδων από ένα γονίδιο που δέχεται ως υπόστρωμα μόνο την DOPA. Επιλέχθηκε το τροποποιημένο γονίδιο της νεφρικής αποκαρβοξυλάσης της DOPA από τον χοίρο (SsDDC) το οποίο δέχεται ως υπόστρωμα μόνο την DOPA δημιουργώντας ένα μονόδρομο μονοπάτι στην παραγωγή υδροξυτυροσόλης. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία το SsDDC μετά από την αλλαγή της τυροσίνης 332 σε φαινυλαλανίνη έχει την ιδιαιτερότητα να πραγματοποιεί ταυτόχρονη απαμίνωση και αποκαρβοξυλίωση στην DOPA. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την δράση του SsDDC ως συνθάση των αρωματικών φαινυλακεταλδεϋδων (DHPAS) και την παραγωγή της αντίστοιχης αλδεΰδης πραγματοποιώντας δύο βήματα του μονοπατιού στην ίδια αντίδραση. Για να ελεγχθεί η ενεργότητα του DHPAS ως προς το υπόστρωμα και τελικά η παραγωγή της υδροξυτυροσόλης, σχεδιάστηκαν in vitro αντιδράσεις με υπόστρωμα την τυροσίνη αλλά και την DOPA. Στις in vitro αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από βακτηριακές καλλιέργειες E. coli από διαφορετικές επαγωγικές συνθήκες (συγκέντρωσης επαγωγέα IPTG). Τα αποτελέσματα από τις in vitro αντιδράσεις δεν έδειξαν καμία ενεργότητα του κλωνοποιημένου γονιδίου DHPAS από τον χοίρο πάνω στην τυροσίνη και την DOPA στις συνθήκες εκτέλεσης του πειράματος.