Πλοήγηση ανά Συγγραφέας "Vourexakis, Michail"

Τώρα δείχνει 1 - 1 of 1
  • Μικρογραφία εικόνας
    Τεκμήριο
    Κλωνοποίηση του γονιδίου HpaBC του Escherichia coli και δημιουργία μεταλλάξεων για την βελτιστοποίηση της παραγωγής L-DOPA από την πρόδρομη ένωση τυροσίνη.
    (ΕΛΜΕΠΑ, Σχολή Γεωπονικών Επιστημών (ΣΓΕΠ), Τμήμα Γεωπονίας, 2024-10-17) Βουρεξάκης, Μιχαήλ; Vourexakis, Michail; Τραντάς, Εμμανουήλ; Trantas, Emmanouil
    Η υδροξυτυροσόλη (ΥΤ) είναι ένας φυτικός δεύτερογενής μεταβολίτης, ο οποίος υπάρχει σε αφθονία στην ελιά. Συγκεκριμένα, απαντάται στα φύλλα, τους καρπούς, το ελαιόλαδο και τα απόβλητα ελαιοτριβείου ως μέρος της σεκοϊριδοειδούς ένωσης ελευρωπαΐνη ή ως ελεύθερη ένωση. Είναι ένα από τα πιο ισχυρά γνωστά φυσικά αντιοξειδωτικά και λόγω των αντιφλεγμονωδών και αντιμικροβιακών ιδιοτήτων της, έχει αποδειχθεί ότι προστατεύει τον οργανισμό ενάντια καρδιαγγειακών παθήσεων και του μεταβολικού συνδρόμου. Επιπλέον, είναι ικανή να μειώσει το οξειδωτικό στρες, προλαμβάνει την οστεοπόρωση και έχει νευροπροστατευτική δράση. Λόγω αυτών των ευεργετικών της ιδιοτήτων, η ΥΤ αποτελεί μία δραστική ένωση, υψηλής εμπορικής αξίας, καθιστώντας την ανάπτυξη διαφόρων πρωτοκόλλων παραγωγής και απομόνωσής της, για εμπορική χρήση, ένα αρκετά ελκυστικό τομέα. Αξιοποιώντας πρωτόκολλα μεταβολικής μηχανικής, έχουν κατασκευαστεί βακτήρια για την παραγωγή ΥΤ ξεκινώντας από διαφορετικά υποστρώματα. Συγκεκριμένα, στο εργαστήριο ΕΒΒΑ έχει επιτευχθεί η δημιουργία μίας μεγάλης συλλογής στελεχών Escherichia coli τα οποία παράγουν ΥΤ. Ένα εκ των γονιδίων που χρησιμοποιούνται σε αυτά τα στελέχη είναι το RsTYR του Ralstonia solanacearum, υπεύθυνο για την υδροξυλίωση της τυροσίνης σε L-DOPA. Ωστόσο, για τη δράση του εν λόγω ενζύμου, κατά την διαδικασία της βιοσύνθεση της ΥΤ, απαιτείται η προσθήκη ιόντων χαλκού, τα οποία οδηγούν στην οξείδωση της L-DOPA και το μαύρισμα του θρεπτικού μέσου. Εναλλακτικά, στη θέση του ενζύμου RsTYR, μπορεί να χρησιμοποιηθεί το HpaBC που κωδικοποιείται στο γονιδίωμα του E. coli. Στην παρούσα διπλωματική εργασία αξιολογήθηκε το ένζυμο HpaBC που κωδικοποιείται στο γονιδίωμα του Escherichia coli, καθώς και μεταλλάξεις αυτού, ως εναλλακτικό ένζυμο έναντι του RsTYR. Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε η απομόνωση του γονιδίου hpaBC από το E. coli, η κλωνοποίηση του στον πλασμιδιακό φορέα pRSF, o μετασχηματισμός βακτηριακών στελεχών του Ε. coli (BL21(DE3) και HMS174(DE3)) με τη συγκεκριμένη πλασμιδιακή κατασκευή και, τελικά, η αξιολόγηση της ικανότητας των στελεχών αυτών να μετατρέψουν την τυροσίνη σε L-DOPA. Ακολούθησαν Fed-batch πειράματα σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες (30°C και 37°C) προκειμένου να βρεθεί η πιο κατάλληλη για την μετατροπή της τυροσίνης σε L-DOPA. Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε υγρή χρωματογραφία υπερ-υψηλής απόδοσης συζευγμένης με φασματογράφο μάζας (UHPLC-MS/MS). Επιτεύχθηκαν αποδόσεις 92% (30°C) και 21% (37°C) από τα στελέχη BL21(DE3) και HMS174(DE3), αντίστοιχα. Επιπλέον, έγινε προσπάθεια δημιουργίας στοχευμένων και τυχαίων μεταλλάξεων του hpaBC. Συγκεκριμένα, και προκειμένου να δημιουργηθούν τυχαίες μεταλλάξεις, εφαρμόστηκε Error-prone PCR (EP-PCR). Από τη διαδικασία αυτή δημιουργήθηκαν 14 μεταλλάγματα του γονιδίου hpaBC. Επίσης, πραγματοποιήθηκε στοχευμένη μεταλλαξιγένεση (Site directed mutagenesis) με βάση την PCR για τη δημιουργία στοχευμένων μεταλλάξεων. Η πιο αποτελεσματική μετάλλαξη κατέγραψε απόδοση 24,8% στους 30°C. Τέλος, αξιολογήθηκε το βιοσυνθετικό μονοπάτι της ΥΤ με το άγριου τύπου hpaBC στη θέση του RsTYR. Από τα fed batch πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στους 30°C προέκυψε μία απόδοση μετατροπής της τυροσίνης σε ΥΤ της τάξεως του 29,72%.