Κλωνοποίηση του γονιδίου HpaBC του Escherichia coli και δημιουργία μεταλλάξεων για την βελτιστοποίηση της παραγωγής L-DOPA από την πρόδρομη ένωση τυροσίνη.
Φόρτωση...
Ημερομηνία
2024-10-17
Συγγραφείς
Τίτλος Εφημερίδας
Περιοδικό ISSN
Τίτλος τόμου
Εκδότης
ΕΛΜΕΠΑ, Σχολή Γεωπονικών Επιστημών (ΣΓΕΠ), Τμήμα Γεωπονίας
Επιβλέπων
Περίληψη
Η υδροξυτυροσόλη (ΥΤ) είναι ένας φυτικός δεύτερογενής μεταβολίτης, ο
οποίος υπάρχει σε αφθονία στην ελιά. Συγκεκριμένα, απαντάται στα φύλλα, τους
καρπούς, το ελαιόλαδο και τα απόβλητα ελαιοτριβείου ως μέρος της
σεκοϊριδοειδούς ένωσης ελευρωπαΐνη ή ως ελεύθερη ένωση. Είναι ένα από τα πιο
ισχυρά γνωστά φυσικά αντιοξειδωτικά και λόγω των αντιφλεγμονωδών και
αντιμικροβιακών ιδιοτήτων της, έχει αποδειχθεί ότι προστατεύει τον οργανισμό
ενάντια καρδιαγγειακών παθήσεων και του μεταβολικού συνδρόμου. Επιπλέον,
είναι ικανή να μειώσει το οξειδωτικό στρες, προλαμβάνει την οστεοπόρωση και έχει
νευροπροστατευτική δράση.
Λόγω αυτών των ευεργετικών της ιδιοτήτων, η ΥΤ αποτελεί μία δραστική
ένωση, υψηλής εμπορικής αξίας, καθιστώντας την ανάπτυξη διαφόρων
πρωτοκόλλων παραγωγής και απομόνωσής της, για εμπορική χρήση, ένα αρκετά
ελκυστικό τομέα. Αξιοποιώντας πρωτόκολλα μεταβολικής μηχανικής, έχουν
κατασκευαστεί βακτήρια για την παραγωγή ΥΤ ξεκινώντας από διαφορετικά
υποστρώματα. Συγκεκριμένα, στο εργαστήριο ΕΒΒΑ έχει επιτευχθεί η δημιουργία
μίας μεγάλης συλλογής στελεχών Escherichia coli τα οποία παράγουν ΥΤ. Ένα εκ
των γονιδίων που χρησιμοποιούνται σε αυτά τα στελέχη είναι το RsTYR του
Ralstonia solanacearum, υπεύθυνο για την υδροξυλίωση της τυροσίνης σε L-DOPA.
Ωστόσο, για τη δράση του εν λόγω ενζύμου, κατά την διαδικασία της βιοσύνθεση
της ΥΤ, απαιτείται η προσθήκη ιόντων χαλκού, τα οποία οδηγούν στην οξείδωση
της L-DOPA και το μαύρισμα του θρεπτικού μέσου. Εναλλακτικά, στη θέση του
ενζύμου RsTYR, μπορεί να χρησιμοποιηθεί το HpaBC που κωδικοποιείται στο
γονιδίωμα του E. coli.
Στην παρούσα διπλωματική εργασία αξιολογήθηκε το ένζυμο HpaBC που
κωδικοποιείται στο γονιδίωμα του Escherichia coli, καθώς και μεταλλάξεις αυτού,
ως εναλλακτικό ένζυμο έναντι του RsTYR. Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε
η απομόνωση του γονιδίου hpaBC από το E. coli, η κλωνοποίηση του στον
πλασμιδιακό φορέα pRSF, o μετασχηματισμός βακτηριακών στελεχών του Ε. coli
(BL21(DE3) και HMS174(DE3)) με τη συγκεκριμένη πλασμιδιακή κατασκευή και, τελικά, η αξιολόγηση της ικανότητας των στελεχών αυτών να μετατρέψουν την
τυροσίνη σε L-DOPA. Ακολούθησαν Fed-batch πειράματα σε δύο διαφορετικές
θερμοκρασίες (30°C και 37°C) προκειμένου να βρεθεί η πιο κατάλληλη για την
μετατροπή της τυροσίνης σε L-DOPA. Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων
χρησιμοποιήθηκε υγρή χρωματογραφία υπερ-υψηλής απόδοσης συζευγμένης με
φασματογράφο μάζας (UHPLC-MS/MS). Επιτεύχθηκαν αποδόσεις 92% (30°C) και
21% (37°C) από τα στελέχη BL21(DE3) και HMS174(DE3), αντίστοιχα.
Επιπλέον, έγινε προσπάθεια δημιουργίας στοχευμένων και τυχαίων
μεταλλάξεων του hpaBC. Συγκεκριμένα, και προκειμένου να δημιουργηθούν τυχαίες
μεταλλάξεις, εφαρμόστηκε Error-prone PCR (EP-PCR). Από τη διαδικασία αυτή
δημιουργήθηκαν 14 μεταλλάγματα του γονιδίου hpaBC. Επίσης,
πραγματοποιήθηκε στοχευμένη μεταλλαξιγένεση (Site directed mutagenesis) με
βάση την PCR για τη δημιουργία στοχευμένων μεταλλάξεων. Η πιο αποτελεσματική
μετάλλαξη κατέγραψε απόδοση 24,8% στους 30°C.
Τέλος, αξιολογήθηκε το βιοσυνθετικό μονοπάτι της ΥΤ με το άγριου τύπου
hpaBC στη θέση του RsTYR. Από τα fed batch πειράματα που πραγματοποιήθηκαν
στους 30°C προέκυψε μία απόδοση μετατροπής της τυροσίνης σε ΥΤ της τάξεως
του 29,72%.
Hydroxytyrosol (HT) is a plant secondary metabolite (PSM), abundantly found in Olea europaea as part of the secoiridoid compound oleuropein. It is present in olive leaves, fruit, olive oil and oil extraction waste products. HT is one of the strongest known natural antioxidants and has anti-inflammatory and antimicrobial qualities. Additionally, it has been shown to confer other benefits against cardiovascular diseases and metabolic syndrome. It also decreases oxidative stress, has neuroprotective and anti-osteoporosis effects. Thus, HT appears to be a promising active natural ingredient of high additive value. Various metabolic engineering protocols have been exploited to engineer bacteria that will produce HT from different precursors. Specifically, in the LBBA laboratory, a large collection of Escherichia coli strains that produce HT has been generated. One of the genes used in these strains is RsTYR of Ralstonia solanacearum, responsible for the hydroxylation of tyrosine to L-DOPA. However, the enzyme’s action, during the process of HT biosynthesis, requires the addition of copper ions, which lead to the oxidation of L-DOPA and the browning of the medium. As an alternative to RsTYR, HpaBC encoded in the E. coli genome can be used. In this thesis, the HpaBC enzyme, encoded in the E. coli genome, and its mutations, evaluated as an alternative protein to RsTYR. For this purpose, the hpaBC gene was isolated from E. coli and cloned into the pRSF plasmid vector. Then E. coli strains BL21(DE3) and HMS174(DE3) were transformed with this construct in order to evaluate their ability to convert tyrosine to L-DOPA. Fed-batch experiments were conducted in two different temperatures (30°C and 37°C), and their results were analyzed by UHPLC-MS/MS. Yields of 92% (30°C) and 21% (37°C) were achieved by the strains BL21(DE3) and HMS174(DE3), respectively. Additionally, targeted and random mutations of hpaBC were generated. More specifically, and in order to generate random mutations, Error-prone PCR (EP-PCR) was performed. This procedure generated 14 mutants of the hpaBC gene. Site directed mutagenesis was also conducted to generate targeted mutations.The most efficient mutant scored a yield of 24.8% bioconversion at 30°C. Finally, the biosynthetic pathway of HT was assessed with wild-type hpaBC in place of RsTYR. From the fed batch experiments that carried out, the final strain reached a 29,72% conversion rate of tyrosine.
Hydroxytyrosol (HT) is a plant secondary metabolite (PSM), abundantly found in Olea europaea as part of the secoiridoid compound oleuropein. It is present in olive leaves, fruit, olive oil and oil extraction waste products. HT is one of the strongest known natural antioxidants and has anti-inflammatory and antimicrobial qualities. Additionally, it has been shown to confer other benefits against cardiovascular diseases and metabolic syndrome. It also decreases oxidative stress, has neuroprotective and anti-osteoporosis effects. Thus, HT appears to be a promising active natural ingredient of high additive value. Various metabolic engineering protocols have been exploited to engineer bacteria that will produce HT from different precursors. Specifically, in the LBBA laboratory, a large collection of Escherichia coli strains that produce HT has been generated. One of the genes used in these strains is RsTYR of Ralstonia solanacearum, responsible for the hydroxylation of tyrosine to L-DOPA. However, the enzyme’s action, during the process of HT biosynthesis, requires the addition of copper ions, which lead to the oxidation of L-DOPA and the browning of the medium. As an alternative to RsTYR, HpaBC encoded in the E. coli genome can be used. In this thesis, the HpaBC enzyme, encoded in the E. coli genome, and its mutations, evaluated as an alternative protein to RsTYR. For this purpose, the hpaBC gene was isolated from E. coli and cloned into the pRSF plasmid vector. Then E. coli strains BL21(DE3) and HMS174(DE3) were transformed with this construct in order to evaluate their ability to convert tyrosine to L-DOPA. Fed-batch experiments were conducted in two different temperatures (30°C and 37°C), and their results were analyzed by UHPLC-MS/MS. Yields of 92% (30°C) and 21% (37°C) were achieved by the strains BL21(DE3) and HMS174(DE3), respectively. Additionally, targeted and random mutations of hpaBC were generated. More specifically, and in order to generate random mutations, Error-prone PCR (EP-PCR) was performed. This procedure generated 14 mutants of the hpaBC gene. Site directed mutagenesis was also conducted to generate targeted mutations.The most efficient mutant scored a yield of 24.8% bioconversion at 30°C. Finally, the biosynthetic pathway of HT was assessed with wild-type hpaBC in place of RsTYR. From the fed batch experiments that carried out, the final strain reached a 29,72% conversion rate of tyrosine.
Περιγραφή
Λέξεις-κλειδιά
Υδροξυτυροσόλη, Κλωνοποίηση, Μεταλλαξιγένεση, Hydroxytyrosol, Cloning, Mutagenesis, Escherichia coli, HpaBC